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牛痘病毒加帽酶 (10 KU/mL)說明書

更新時間:2023-10-24      點擊次數(shù):743

牛痘病毒加帽酶 (10 KU/mL)說明書

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產(chǎn)品描述

真核生物中mRNA經(jīng)轉(zhuǎn)錄后修飾在5'端形成一個特殊結(jié)構(gòu),即帽子結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)對mRNA的穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運(yùn)與翻譯過程均有較重要作用。牛痘病毒加帽酶是催化形成帽子結(jié)構(gòu)的有效酶,其由D1和D12兩個亞基組成,兼具RNA三磷酸酯酶活性、鳥苷酰基轉(zhuǎn)移酶活性和鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶活性,可將7-甲基鳥嘌呤帽結(jié)構(gòu)(m7Gppp)連接到RNA的5'末端(m7Gppp5'N)。牛痘病毒加帽酶,在合適濃度的加帽緩沖液(Capping buffer),鳥苷三磷酸(GTP),S-腺苷甲硫氨酸(SAM)等存在條件下,能夠在一個小時之內(nèi)對RNA進(jìn)行加帽,并且保證正確的方向。

本品以無菌液體形式提供,可應(yīng)用于體內(nèi)/體外翻譯前mRNA的加帽反應(yīng)或mRNA的5'末端標(biāo)記反應(yīng)。

產(chǎn)品組分

組分名稱

產(chǎn)品編碼/規(guī)格

78MRNA-1105A(500 U)

78MRNA-1105B(2000 U)

78MRNA-1105C(10000 U)

10×Capping Buffer

150 ul

500 ul

1.25 mL×2

SAM(32mM)

50 ul

200 ul

1 ml

RNase free water

1ml

1ml

1mlx3

Vaccinia Virus Capping Enzyme (10 U/μL)

50 ul

200 ul

1 mL












產(chǎn)品性質(zhì)

來源(Source)

攜帶牛痘病毒加帽酶基因的E. coli

最適溫度(Optimum Temperature)

37℃

儲存緩沖液(Storage Buffer)

20 mM Tris-HCl pH 8.0,100 mM NaCl,1 mM DTT,0.1 mM EDTA,0.1% Triton X-100,50%甘油

活性單位定義(Unit Definition)

37℃條件下,1小時內(nèi)將10 pmol GTP(α- 32P)摻入到一條含80個核苷酸(80 nt)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上所需要的酶量,即為1個單位。

產(chǎn)品應(yīng)用【 加帽反應(yīng) 】適用于10 μg RNA(≥100 nt)的加帽反應(yīng),反應(yīng)體系20 μL,且可根據(jù)實驗需要放大。1. 取10 μg RNA,用RNase free water將適量RNA稀釋至15 μL;2. 將RNA置于65℃加熱5 min,結(jié)束后冰上放置5 min;3. 按照右側(cè)表格依次加入各組分;4. 37℃反應(yīng)30 min;5. RNA加帽完成,可進(jìn)行后續(xù)實驗。

組分體積
Denatured RNA15 ul
10×Capping Reaction Buffer2 ul
GTP (10 mM)1 ul
SAM (2 mM)1 ul
Vaccinia Capping Enzyme (10 U/μL)1 ul
Total volume20ul

【 5′ 末端標(biāo)記反應(yīng) 】本步驟適用于 5′末端帶有三磷酸的RNA標(biāo)記,且可根據(jù)實驗需要放大。其標(biāo)記效率受反應(yīng)體系中RNA與GTP摩爾濃度比以及RNA樣本中GTP含量影響。1. 用RNase Free Water將適量RNA稀釋至14 μL;2. 將RNA置于65℃加熱5 min,結(jié)束后冰上放置5 min;3. 按照右側(cè)表格依次加入各組分;4. 37℃孵育30 min;5. RNA 5′末端標(biāo)記完成,可進(jìn)行后續(xù)實驗。

組分體積
Denatured RNA14 ul
10×Capping Reaction Buffer2 ul
GTP Mix2 ul
SAM (2 mM)1 ul
Vaccinia Capping Enzyme (10 U/μL)1 ul
Total volume20 ul

*注:GTP Mix為GTP和少量標(biāo)記物,GTP儲液應(yīng)稀釋為反應(yīng)體系中mRNA摩爾濃度的1~3倍。 注意事項:(1)用于加帽反應(yīng)的RNA在使用前應(yīng)進(jìn)行純化并溶解于RNase free water 。溶液中不能含有EDTA和鹽。(2)加帽酶反應(yīng)前加熱RNA可以去除轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5′的二級結(jié)構(gòu)。如果轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5′端結(jié)構(gòu)復(fù)雜,可將加熱時間延長至10 min。(3)如果轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5′端結(jié)構(gòu)復(fù)雜,為提高加帽效率可將反應(yīng)時間延長至120 min。(4)SAM在室溫下會逐漸降解,SAM降解會導(dǎo)致N 7 甲基化效率降低,會進(jìn)一步導(dǎo)致加帽失敗,因此需始終放置在冰上。此外,也可以通過體系優(yōu)化適當(dāng)提高用量以保證加帽反應(yīng)順利進(jìn)行。 其他用途可參考上述用途或相關(guān)文獻(xiàn)資料進(jìn)行實驗

運(yùn)輸和保存方法

干冰運(yùn)輸。-20 oC保存,避免反復(fù)凍融,有效期1年。

注意事項

1. 為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作;

2. 所提取的RNA需經(jīng)過純化并使用無核酸酶的水重懸;

3. 在加入酶之前需要對RNA溶液進(jìn)行加熱以去除5'末端的二級結(jié)構(gòu);

4. 對于已知5'末端結(jié)構(gòu)的RNA,可以延長反應(yīng)時間至60分鐘,提高加帽效率;

5. 5'末端標(biāo)記反應(yīng)體系中,GTP儲液應(yīng)稀釋為反應(yīng)體系中mRNA摩爾濃度的1-3倍。


貨號品名規(guī)格品牌
78MRNA-1105A牛痘病毒加帽酶 (10 KU/mL)500 U

BIOHUB

78MRNA-1105B牛痘病毒加帽酶 (10 KU/mL)2000 U

BIOHUB

78MRNA-1105C牛痘病毒加帽酶 (10 KU/mL)10000 U

BIOHUB







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